Método de sondagem de DNA geomarcado não radioativo

Princípios experimentais

Anteriormente, as pessoas usavam isótopos radioativos para marcar o DNA da sonda. Nos últimos anos, os métodos de marcação não isótopica se desenvolveram rapidamente e houve uma tendência para substituir os métodos de marcação isótopica. O método de sondagem de DNA com marcação aleatória com base geográfica é um método de marcação não isótopica mais bem sucedido (Saiki et al., 1985). Seu princípio é: ligação química de poliméricos semiantigénicos de esteroides a dUTP (Dig-dUTP). Utilizando precursores aleatórios e DNA polimerases, usando DNA da sonda como modelo para sintetizar DNA complementar, dUTP modificado químicamente é incorporado simultaneamente na sonda de DNA marcada. Antigeomonomab marcado com fosfatase alcalina após a hibridação se liga ao Dig-dUTP no DNA da sonda de marcação, adicionando um substrato colorido e transformando-se em compostos marrom escuro ou azul sob a ação da fosfatase alcalina. Ou com a radiografia de filme X. O processo básico de marcação de DNA de altitude é: preparar a sonda de DNA, a sonda de marcação, a amostra de teste. Um passo fundamental é obter uma sonda de alta sensibilidade e alta especificidade.
Marcação: O método de marcação de primeiros aleatórios pode marcar menos de 10ng e até 3ug de DNA. Pode ser incorporado um Dig-dUTP a cada 20-25 nucleótidos da cadeia de DNA recém-sintetizada, com um tempo de reação de aproximadamente 1 h.
Hibridade: realizada de acordo com o método híbrido padrão. Podem ser usadas membranas de nylon ou nitrato de celulose. O líquido híbrido usado pode ser congelado a -20 ° C e reutilizado.
Teste imunológico: após o bloqueio, a etapa * da resposta de detecção, o composto anticorpo se liga ao DNA marcador, aparece um DNA semiantígeno-marcador híbrido, a reação de coloração começa com a adição de colorantes incolores X-fosfato e nitrilatetrazol NBT em condições de pH alcalino, em poucos minutos começa a aparecer azul, o processo de coloração dura 3 dias. Um exemplo típico é o fim da reação de coloração após 24 horas. Depois de lavar a cor da película de nylon com dimetilformalimida, a película de nylon pode ser reutilizada para a hibridação.
Aplicação: sonda de DNA marcado com base geográfica e kit de teste, que pode detectar 0,1 pg de DNA homógeno, pode detectar uma única cópia de genes em 1 µg de DAN de mamíferos, em comparação com o sistema de marcação radioativa, este kit pode obter resultados experimentais rapidamente (desde a marcação do DNA e o cruzamento até ver os resultados do teste dentro de 24 horas), e elimina os problemas de insegurança radioativa. A sensibilidade e a especificidade do reagente tornam-no adequado para todas as técnicas de hibridação (incluindo transferência de DNA-impressão, hibridação de colônias, hibridação de placas e hibridação in situ) como alternativa à marcação isotópica e à autoradiografia.

Reagentes experimentais

O tampão de diluição de DNA tem dois tubos de 1 ml por tubo:

[Composição: Tris-HCl (10 mM), EDTA (1 mM), pH 8,0 (20 ° C)] contém DNA de salmão (50 µg / ml).

2. Mistura de hexanucleótidos

Substrato misto marcado: este tubo contém 50 µl de concentração de substrato misto marcado com dNTP, contendo dATP (1 mL), dCTP (1 mM), dGTP (1 mM), dTTP (0,65 mM) e Dig-
dUTP (0,35 mM), pH 6,5 (20 ℃).

4. DNA polimerase I grande segmento (grau de marcação): Este tubo contém 25 µl, DNA polimerase I grande segmento (Klenow), 2 U / µl.

5. (Dig) AP composto: Este tubo contém 200 µl, polyclonal ovelha anti-terreno alta distribuição Fab-fragmento, ligado com fosfatase alcalina 750 U / ml.

O NBT tem dois tubos de 1,25 ml por tubo, dissolvidos em solução salina de nitrotetrazol (75 mg / ml) de 70% (V / V) dimetilformalamida.

X-fosfato, dois tubos, 0,9 ml por tubo, em solução de metamina de 5-bromo-4-cloro-3-fosfato de dimetilformalamida (50 mg / ml).

Reagentes de bloqueio, duas garrafas, cada garrafa com 50g de pó.

Solução necessária:

EDTA (0.2M), pH8.0 (20 ℃)
LiCl (4M)
70% (V/V) etanol
Tris-HCl (10mM)
EDTA (1mM), pH8.0 (20 ℃)
10% (V / V) N-docealquil-mionina sal sódico
10% (V / V) SDS
0.3M citrato trisódico
NaCl 3M
20×SSC
pH7.0, Tris-HCl (100mM)
NaCl (150mM)
pH7.5Tris-HCl (100mM)
MgCl₂(50mM) pH9.5 (20 ℃)
NaCl (100mM)

Passos experimentais

1. Tome 10 µl de DNA a ser testado e faça eletroferese em gel de 1,0% de againe.

2. O gel é tingido com bromuro de etileno, cortar o excesso ao redor do gel e marcar no canto do gel, tirar uma foto e registrar os resultados da eletrofese (ao tirar uma foto, colocar um metro ao lado do gel).

3. Preparação de cola híbrida
(1) Mergulhe o gel em 30 mL de solução de HCl 0,25 M por 15 min para despurinar o DNA.
(2) Lave o gel duas vezes com água destilada.
(3) Mergulhe o gel em 30mL de NaOH 0,4M por 30min para neutralizá-lo.

4. Plataforma para preparar a transferência de DNA do gel para a membrana
(1) Corte 1 folha de nylon para uso e 3 folhas de papel de filtro grosso no mesmo tamanho que a cola para transferência e marque no canto da película de nylon.
(2) Outra folha de papel de filtro espessa cortado na mesma largura do gel, comprimento (cerca de 18 cm) suficiente para alcançar o fundo da caixa de líquido de transferência.
(3) Prepare o líquido de transferência 10 X SSC.
(4) Depois de molhar a membrana de nylon com água destilada, mergulhe no líquido de transferência 10 X SSC.

5. Instalação do dispositivo de transferência capilar
(1) Coloque o papel de filtro comprido no topo da plataforma de transferência, as duas extremidades do papel de filtro chegam ao fundo da caixa de transferência, tornando-se uma ponte de absorção de arco.
(2) Verta 8 0mL de líquido de transferência na caixa de transferência e umede o papel de filtro.
(3) Coloque a parte de trás do gel para cima na ponte de papel de filtro, evitando bolhas entre o gel e o papel de filtro.
(4) Feche os quatro lados do gel com papel conservante.
(5) Coloque a membrana de transferência úmida na parte superior do gel para evitar bolhas entre o gel e a membrana.
(6) Coloque os restantes 3 folhas de papel de filtro cuidadosamente sobre a película de transferência e coloque uma pilha de papel de absorção de água sobre o papel de filtro, depois coloque uma placa de vidro, que pressiona uma carga pesada.
(7) Transferência por algumas horas ou pernoite (pelo menos 4 horas)
Atenção: Não deixe o líquido de transferência secar.

6. O DNA transferido é entrelaçado com a membrana
(1) Coloque a membrana em papel de filtro espesso imerso em 10 X SSC, com um lado de DNA para cima.
(2) Coloque a membrana no crosslinker UV e entrecruze-se automaticamente por 3 minutos sob a luz ultravioleta.
(3) Lavar a membrana entrelaçada com água destilada por um curto período e secar no ar.
Esta membrana pode ser conservada por um longo tempo a 4 ° C.

Cada resposta padrão pode marcar de 10ng a 3ug de DNA linear ou marcar quantidades maiores de DNA, mas todos os componentes e volumes devem ser aumentados de acordo.

(1) Degradação térmica da sonda de DNA, ferver 10 min, resfriar rapidamente no gelo / etanol por mais de 5 min, para uso.

(2) Tome o tubo Eppendorf (1,5 ml) e coloque no gelo, adicionando o seguinte e o reagente:

DNA recém-degenerado 1-3 µg

Mistura de hexanucleótidos 2µl

Substrato misturado para marcação dNTP 2µl

Adicionar água estéril a vapor pesado até 19 µl

DNA polimerase I grande fragmento (Klenow 5U / ul) 1 µl

(3) Isolamento a 37 ° C pelo menos 60min, até 20h.

(4) Cobrir 5min, terminar a reação.

(5) 15000rpm centrífuga 30s, colocado no gelo para uso.

8. pré-híbrido Pressão 100cm²A membrana é usada com 20-40 ml de solução de pré-hibridação, deixando a solução em fluxo durante a pré-hibridação.

Composição pré-híbrida: 5 x SSC

Reagentes fechados de 0,5% (W / V): 1% de polisacarose (Ficool 400), 1% de PVP, 1% de BSA.

0,1% (W / V) N-docenilcreatina de sódio

0,02% (W / V) SDS

A membrana é colocada em um saco de plástico, encher o líquido pré-hibridação, excluir o gás e selar após a pré-hibridação durante a noite a 65 ° C.

9. híbrido Pressão 100cm²A membrana é usada com 2,5 ml de líquido híbrido, agitando ocasionalmente o saco híbrido durante a hibridação para que a solução dentro seja redistribuída.

Composição híbrida: 50% Formamida (V/V)

Reagente fechado de 5% (W/V)

5×SSC

0,1(W/V)N-docenilcrinina de sódio

0,02% (W / V) SDS

Novo marcador de DNA (150 ng/ml)

O líquido híbrido substitui o líquido pré-híbrido, a substituição da membrana não pode secar, a substituição bem sucedida deve ser a formação de uma camada de membrana híbrida entre a membrana e o saco de plástico. Passe a noite a 42°C (16 a 20 horas).

10. Película de lavagem Pressão 100cm²A membrana é calculada com 250 ml de líquido de lavagem da membrana.

(1) Lavar a temperatura ambiente com 2 x SSC / 0,1% (W / V) solução SDS, 5min, 2 vezes.

(2) Lavar com solução de 0,1 x SSC / 0,1% SDS em 65 ° C, 10 min, 2 vezes.

(3) Lavar 1 vez a temperatura ambiente com uma solução de SSC 2 x.

11. Teste imunológico

(1) Solução de preparação

缓冲液1： Tris-HCl (100mM); NaCl (150mM) pH7.5 (20 ℃)

Tampon 2: 0,5% (W / V) reagente de bloqueio (tubo 11), preparado no tampão 1 (o reagente de bloqueio não se dissolve rapidamente, portanto, esta solução deve ser preparada 1 hora antes, dissolvendo o reagente a 50 ~ 70 ° C, mantendo a solução turbia).

缓冲液3： Tris-HCI (100mM); NaCI (100mM); MgCI2 (500mM) pH 9,5 (20 ℃).

缓冲液4： Tris-HCl (10mM); EDTA (1mM); pH 8.0 (20 ℃)

Solução de coloração: recém-formulada, adicionando 45 µl de solução de NBT (tubo 9) e 35 µl de tampão de X-fosfato em 10 ml de tampão 3.

2) Processo de cor

A membrana é lavada brevemente em tampão 1 (1 min).

B. Isolar 30 min em tampão de 100ml 2.

C. Lavar novamente com tampão 1.

D. O composto anticorpo diluído com tampão 1 até 150U/L (1:5000); O composto anticorpo diluído é estável a 4 ° C apenas por 12 h.

E. A membrana é isolada por 30 min em 20 ml de solução de composto anticorpo diluído.

F. Lave a película com 100 ml de tampão 1 para remover os compostos anticorpos não ligados, 15 min, 2 vezes.

G. A membrana é equilibrada em tampão 3 por 2 min.

H. Em condições escuras, a membrana com a solução de coloração de 10 ml é colocada dentro de um saco de plástico selado ou colocado dentro de uma caixa apropriada, a cor começa a aparecer dentro de alguns minutos, a reação de coloração geral é completa após 1 dia. Quando a cor aparece, não deve oscilar ou agitar.

I. Quando os pontos ou faixas solicitados tiverem sido detectados, a reação pode ser terminada em 5 minutos com tampão de 50 ml.

J. Câmera.

Descrição: Todas as reações acima são realizadas a temperatura ambiente e, exceto a reação de coloração, requerem oscilação ou agitação.

Precauções

Consideração quando o DNA não pode ser efetivamente marcado

(1) Depositação com fenol / extração e / ou etanol para purificar novamente o DNA.

(2) Tempo de isolamento prolongado da reação de marcação (aumentado para 20h).

(3) A degeneração do DNA pode não ser possível*, o que é especialmente importante para grandes segmentos de DNA.

Considerar quando a sensibilidade esperada não é alcançada

1) Taxa de marcação de DNA.

(2) Aumentar a concentração de DNA marcado ou aumentar o tempo de cruzamento.

(3) O tempo de reação pode ser prolongado até 3 dias.

Se o fundo for muito profundo, você pode

(1) Reduzir a quantidade de DNA marcado em solução híbrida.

(2) Aumentar o volume da solução híbrida para que a membrana flutuasse arbitrariamente na solução.

(3) Alguns tipos de membrana de nylon podem ter um fundo escuro, portanto, outros tipos de membrana de nylon podem ser usados ​​ou membrana de celulose nitrata.

(4) Aumentar a concentração do reagente bloqueador durante o processo de hibridação e teste.