Três métodos de extração de RNA de materiais vegetais

Passos experimentais

Extração de RNA Total com o RNeasy Plant Mini Kit

1) Adicionar 0,5 ml de tampão RLT e 5 ul de beta-mercetiletanol em um tubo centrífugo de 1,5 ml;

2) Pesar cerca de 100 mg de material, transferir para o líquido de extração após a moagem de nitrogênio líquido, misturar em vortex, 56 ° C, 2 min;

3) Adicionar uma coluna roxa, 23 ° C, 12000 rpm, centrífuga 2 min;

4) Transferir o filtro para um novo tubo de centrifugação de 1,5 ml, adicionar 1/2 do volume de etanol anhidro, misturar com a cabeça da pistola, mover para a coluna rosa, 23 ° C, 12.000 rpm, centrifugar por 15 sec;

5) filtro descartado, adicionar 700 ul RW 1, 23 ℃, 12.000 rpm, centrífuga 15 sec;

6) Mova a coluna para um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionando 500 ul RPE, 23 ° C, 12.000 rpm, centrífuga por 15 sec;

7) filtro descartado, adicionar 500ul RPE, 23 ℃, 12000 rpm, centrífuga 2 min;

8) Adicione 20 ul de água tratada com DEPC, deixe em reposo a temperatura ambiente por 15 min, 23 ° C, 12.000 rpm, centrífuga por 1 min;

9) Adicione 40 ul e 20 ul de água tratada com DEPC, respectivamente, e deixe a temperatura ambiente em reposição por 15 min, 23 ° C, 12.000 rpm centrífuga por 1 min;

10) Combinar o RNA coletado três vezes e tomar 2ul eletroforese para detectar pureza e qualidade. -20 ° C para conservação de curto prazo, ou -80 ° C para conservação de longo prazo.

Extração de RNA com o kit TRIZOL

1) Adicionar 1 ml de extrato TRIZOL em um tubo centrífugo de 1,5 ml;

2) Pesar o material após a moção de cerca de 100 mg de nitrogênio líquido, transferir para o líquido de extração, misturar, 2-8 ° C, ≤ 12.000 g de centrifugação 10-15 min;

3) Tome a limpeza, coloque 5min a 15-30 ℃, adicione 0,2 ml, agite fortemente 15 sec, 15-30 ℃ coloque 2-3min, 2-80C, ≤12000 g, centrífuga 15 min;

4) Tomar a fase aquática, adicionar isopropanol de volume equivalente, colocar 15-30 ° C em 10 min, 2-8 ° C, < 12.000 g, centrífuga em 10 min;

5) Lavar o precipitado com 75% de etanol, 2-8 ℃, <7500g centrífuga 5 min; O RNA dissolvido em água tratado com DEPC, conservado por um curto período de tempo a -20 ° C, ou conservado a longo prazo a -80 ° C.

CTAB extrai o RNA total das plantas

1) Adicionar 15 ml de tampão de extração CTAB em um tubo centrífugo de 50 ml (adicionar 300 ul de beta-mercetiletanol), pré-aquecimento a 65 ℃;

2) 2-3 g de material vegetal fresco, completamente moído em pó em nitrogênio líquido;

3) Transferir a amostra em um tubo de centrifugação de 50 ml, agitar rapidamente e misturar para nenhum bloco de união, banho quente de 65 ° C por 10 min, adicionar 15 ml e misturar;

4) A temperatura ambiente, 10.000 rpm, centrífuga 15 min, a fase de água superior é movida para um novo tubo centrífugo, adicionar o volume de outros, misturar depois de extrair novamente;

5) Transferir a fase aquática superior para outro tubo centrífugo e adicionar 8M de LiCl para que a concentração final seja de 2M (cerca de 1/3 da fase aquática adicionada), 4 ° C, durante a noite;

6) 4 ° C, 12000 rpm, centrifugar 20 min precipitação de RNA descartado, lavar o precipitado com 70% de etanol e secar;

7) Adicionar 500ul SSTE precipitado dissolvido, transferir para um tubo centrífugo de 1,5 ml, adicionar outros volumes de fenol ácido / após mistura;

8) A temperatura ambiente, 13.000 rpm, centrífuga 10 min, transferir a fase aquática superior para outro tubo centrífugo de 1,5 ml, adicionar o volume e outros após a mistura;

9) A temperatura ambiente, 13.000 rpm, centrífuga 10 min, transferência da fase aquática superior para um novo tubo, adicionando 1/10 do volume de NaAC 3M e 2 vezes o volume de etanol anhidro, -80 ° C em reposição 30 min;

10) 4 ° C, 13.000 rpm, centrífuga 20 min, 70% etanol lavagem precipitação, após secagem adicionar 50 ul DEPC tratamento H₂0 dissolver o RNA, tomar 1ul para a detecção de eletroforese, -80 ° C para conservar em reposição.

Purificação do RNA

1) Adicionar em um tubo centrífugo de 1,5 ml para tratamento de água DEPC: 45 ul de RNA, 7,5 ul de tampão de ensaio l0XDnase, 20 U de inibidor de RNase 1,5 ul de Dnase I, mistura em banho quente a 37 ° C por 30 min;

2) Utilização do DEPC-H₂0 ajustar o volume da solução para 250 ul, adicionar 1/10 do volume de NaAC 3 M (pH 5,2) e 2 vezes o volume de etanol sem água frio, misturar, colocar a -20 ° C por 30 min;

3) 4 ° C, 12000 rpm, centrífuga 20 min, precipitação de RNA;

4) 70% de etanol pré-refrigerado a -20 ° C lavar uma vez e 100% de etanol pré-refrigerado a -20 ° C lavar uma vez;

5) Após a secagem, H tratado com 20 ul DEPC₂O溶解，-20℃保存。