Cosméticos teste de promoção da síntese de colágeno in vitro

Cosméticos teste de promoção da síntese de colágeno in vitro

Princípio de teste e caminho técnico

O colágeno é um componente central para manter a elasticidade da pele e sua capacidade de síntese afeta diretamente as funções anti-rugas e reparadoras da pele. Os testes de promoção da síntese de colágeno in vitro de cosméticos avaliam os efeitos estimulantes da biosíntese de colágeno do sujeito através da criação de modelos de cultura de fibrócitos que simulam o ambiente fisiológico do epicórtex da pele. O sistema de teste foi estudado com fibrócitos cutâneos humanos (HDF) ou linhas de fibrócitos eternos (como NHDF) para verificar duas vezes as mudanças na capacidade de síntese de colágeno a partir de níveis de proteínas e níveis genéticos após intervenção do ensaio em condições de cultura padronizadas (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade).

O projeto experimental usou o método de gradiente de concentração (geralmente 0,01%, 0,1% e 1% em três grupos de dose), configurando o controle em branco (sem meio sérico) e o controle positivo (vitamina C 100 μmol / L) para garantir a comparabilidade e confiabilidade dos resultados. Os principais princípios tecnológicos baseiam-se na estimulação dos componentes ativos pelos fibrócitos, que aumentam a expressão do gene COL1A1 através da ativação da via de sinalização TGF-β / Smad e promovem a secreção de colágeno tipo I. O teste requer validação de citotoxicidade sincronizada (método MTT), exigindo que os sujeitos tenham uma taxa de sobrevivência celular > 80% em concentrações eficazes, excluindo a proliferação celular ou a toxicidade que interfera com os resultados do teste.

Métodos de teste básicos e processos de padronização

Quantificação de níveis de proteína: ELISA para determinar o teor de colágeno tipo I

Usando o método de imunoassorção ligada a enzimas (ELISA) para detectar especificamente a concentração de colágeno tipo I (COL1) no líquido de cultura celular, o processo operacional segue estritamente as especificações técnicas GB / T 35828-2018 "Guia de teste de eficácia de modelos de pele 3D in vitro de cosméticos". As etapas específicas incluem:

pré-tratamento da amostra: recolha a intervenção de 72 horas de líquido sobre a célula, centrifugação de 4 ° C 12000rpm para remover as impurezas em 10 minutos;

Pacote de anticorpos é: 96 furos de placa pacote de anticorpos monoclonais anti-COL1 humano de rato (diluído 1: 1000), incubada durante a noite em 4 ℃;

Ligação de antígeno: adicionar a amostra diluída em gradiente e o produto padrão (0-200ng / mL), incubar a 37 ° C por 2 horas;

Reação de coloração: adição de marcador HRP diante (diluição 1: 2000) e substrato TMB, após terminar a reação para medir a absorção no comprimento de onda de 450 nm;

Cálculo de dados: Conversão da concentração de COL1 por meio de curvas padrão, comparando o grupo experimental com o grupo de controle para calcular a taxa de síntese relativa, exigindo que o conteúdo de COL1 do grupo de resultados positivos aumentasse ≥ 20% em relação ao controle em branco (p < 0,05).

Verificação de níveis genéticos: PCR em tempo real para detectar a expressão de COL1A1

Para revelar o mecanismo molecular da síntese de colágeno, é necessário usar PCR quantitativa fluorescente em tempo real (qPCR) para detectar mudanças nos níveis de transcrição do gene COL1A1, o processo experimental é o seguinte:

Extração total de RNA: células fissadas por Trizol, concentração de RNA medida por Nanodrop (proporção A260/A280 1,8-2,0);

Reação de transcrição inversa: sintetização de cDNA com o kit PrimeScript RT em condições de reação de 37 ° C por 15 minutos e 85 ° C por 5 segundos;

Amplificação qPCR: com GAPDH como endogene, a sequência de iniciador COL1A1 é F: 5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3', R: 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3', amplificado no sistema LightCycler 480 (10 minutos de predisposição a 95 ° C, 40 ciclos: 15 segundos a 95 ° C, 30 segundos a 60 ° C);

Análise dos resultados: para calcular a expressão relativa de COL1A1 usando o método 2^(-ΔΔCt), os sujeitos positivos devem aumentar a expressão genética ≥ 1,5 vezes, de acordo com a tendência de mudança nos níveis de proteína.

Critérios de Controle de Qualidade e Determinação de Resultados

Controle de qualidade do sistema experimental

Garantia de qualidade celular: uso de células de crescimento logaritmico de geração 3-10, a densidade de vacinação é controlada em 5 x 104 células / cm² para garantir a taxa de adesão celular > 90%;

Normalização do reagente: o soro fetal bovino precisa passar pela detecção de brongênio, a concentração de albinase pancástica é estritamente controlada em 0,25%, a quantidade de adição de EDTA é de 0,02%;

Requisitos de precisão do instrumento: flutuação de temperatura do compartimento de cultivo de CO2 ≤ ± 0,1 ° C, valor de pH mantido 7,2-7,4. mesa de trabalho ultra-limpa deve atingir a limpeza do nível ISO 5 (partículas em suspensão ≤ 3520 / m³);

Verificação metodológica: precisão intra-lote RSD < 8%, precisão entre lotes RSD < 12%, taxa de recuperação 90% -110%; Eficiência de amplificação qPCR 90%-110%, coeficiente de correlação R² > 0,99.

Determinação do limiar

Critério de base: O sujeito pode ser considerado positivo em concentrações não citotóxicas (taxa de sobrevivência > 80%) e satisfazer qualquer das seguintes condições:

O teor de colágeno tipo I aumentou ≥20% em relação ao controle em branco (ELISA, p<0.05);

Expressão do gene COL1A1 aumenta ≥ 1,5 vezes (qPCR) p<0.05)。

Requisitos de validação reforçados: Os produtos que afirmam "promover significativamente a síntese de colágeno" devem satisfazer simultaneamente um aumento de ≥ 30% nos níveis de proteína e um aumento de ≥ 2 vezes nos níveis de genes e fornecer pelo menos três repetições de experimentos independentes.

Vantagens técnicas e garantias de conformidade

Infraestruturas de hardware e capacidade técnica

O centro de teste de medicina chinesa está equipado com laboratórios de biossegurança de nível 3 e equipamentos principais incluem:

Thermo Scientific Heracell VIOS: monitoramento e alarme em tempo real de temperatura e concentração de CO2;

Estação de trabalho de ELISA de alto fluxo (BioTek 800TS): suporta a detecção simultânea de 96 amostras com limites de detecção de até 0,1 pg/mL;

PCR quantitativa fluorescente (Roche LightCycler 96): equipado com um módulo de refrigeração de elevação rápida, uma única experiência pode ser concluída em 2 horas;

Sistema de imagem celular (Olympus IX73): Análise quantitativa da intensidade da imunofluorescência do colágeno em combinação com o software ImageJ.

Qualificação e credibilidade dos dados

O laboratório é reconhecido pela CNAS (número de certificado CNAS L22006) e qualificado pela CMA, e o processo de teste segue rigorosamente:

Norma nacional: GB / T 35828-2018 "Guia de teste de modelos de pele in vitro de cosméticos";

Normas internacionais: OECD TG 439 “Teste in vitro de estimulação da pele”, ISO 10993-5 “Teste de citotoxicidade”;

Guia do setor: China Cosmetics Review Center "Cosmetics Eficacy Claims Evaluation Guidelines" (Edição de 2021).

Serviços de inspeção personalizados

Suporte técnico completo para diferentes tipos de cosméticos:

Triagem de matérias-primas: pré-triagem in vitro de extratos vegetais, peptídeos e outros ingredientes eficazes para encurtar o ciclo de pesquisa e desenvolvimento;

Otimização da fórmula: avaliar o efeito de conservantes e fragrâncias na atividade de síntese de colágeno, otimizar o esquema de replicação;

Verificação de estabilidade: armazenamento em condições de 4 ℃, 25 ℃, 40 ℃ por 28 dias para monitorar o efeito da degradação dos ingredientes ativos na eficácia;

Serviço de Valor Adicionado de Dados: Interpretação profunda de dados como análise da via genética COL1A1, cálculo de IC50/EC50 do componente ativo.

Aplicações da indústria e casos típicos

Um soro anti-envelhecimento validado pelo sistema de teste mostrou que, 48 horas após a intervenção do grupo de concentração de 1%, a secreção de COL1 fibroblastica aumentou em 42,3% (p < 0,01), a expressão de mRNA de COL1A1 aumentou 2,1 vezes e a taxa de sobrevivência celular atingiu 91,7%. Os dados apoiam com sucesso a sua afirmação de eficácia de "promover a síntese de colágeno", e os relatórios de teste relevantes são reconhecidos pela Administração Nacional de Farmacêutica como base para o registro. A prática mostra que os testes padronizados de síntese de colágeno in vitro podem substituir eficazmente os experimentos em animais tradicionais, garantindo a precisão do teste, ao mesmo tempo que reduzem drasticamente os custos de pesquisa e desenvolvimento e as controvérsias éticas, fornecendo apoio científico e técnico confiável para a avaliação da eficácia dos cosméticos.