3T3-L1 (fibrócitos embrionários de rato)

Métodos de conservação celular:

a) Congelação das células

Preparação de líquido de cultura congelado contendo 10% de DMSO ou glicerina, 10 a 20% de soro de bezerro;

2. Tome as células logarithmicas, remova a cultura antiga e limpe com PBS.

Remover o PBS e adicionar quantidades apropriadas (cobrindo a superfície do prato de Petri) para digerir as células de crescimento de uma camada;

Centrífuga 1000rpm, 5min;

Remover, adicionar a quantidade adequada de líquido congelado preparado, soprar suavemente com uma suína para que as células sejam uniformes, contagem, regulação da densidade final das células no líquido congelado é de 5 x 106 / ml a 1 x 107 / ml;

Dividir as células em tubos de congelamento, de 1 a 1,5 ml por tubo;

Indique no tubo de congelamento o nome da célula, o tempo de congelamento e o operador;

Congelação: o procedimento de congelamento padrão é a taxa de refrigeração de -1 a -2 ° C / min; Quando a temperatura está abaixo de -25 ℃, pode ser aumentada para -5 ℃ ~ 10 ℃ / min; A -100 ° C, pode ser rapidamente imerso em nitrogênio líquido. O tubo de congelamento com células também pode ser colocado no frigorífico de -20 ° C por 2h e, em seguida, colocado no frigorífico de -70 ° C durante a noite, remover o tubo de congelamento e mover-se para o recipiente de nitrogênio líquido.

Informação do produto:

Introdução do produto:

Passos operacionais:

1) substituir meio ou todo o meio 24-48 horas antes do congelamento para que as células estejam no período de crescimento exponencial.

2), preparação de solução de conservação congelada (preparação pré-uso): extrair um tubo centrífugo, adicionar o meio de cultura, soro, gota a gota adicionar dimetil sulfato (DMSO) a uma concentração de 20%, ou seja, fazer o dobro do líquido congelado, colocado a temperatura ambiente para uso.

3), coleta centrífuga de células cultivadas, suspender as células com o peso do meio de cultura adicionado ao soro, tomar uma pequena quantidade de suspensão celular (cerca de 0. 1 ml) conta a concentração celular e a taxa de sobrevivência pré-congelamento.

4) Tome uma quantidade equivalente de suspensão celular, adicionar lentamente gota a gota a suspensão celular e agitar o tubo de ensaio para fazer a suspensão de congelamento celular (concentração após DMSO de 5 a 10%), para que a concentração celular seja de 1 a 5 x 106 células / ml, misturada uniformemente, dividida no tubo de congelamento marcado, 1 a 2 ml / vial, e tome uma pequena quantidade de suspensão celular para teste de poluição. Após o fechamento, indique o nome da célula, a álgebra e a data. Em seguida, o congelamento.

Atenção:

As células que desejam ser congeladas devem estar em um estado de bom crescimento e alta taxa de sobrevivência, com cerca de 80 a 90% de densidade. Para verificar se as células ainda conservam suas propriedades antes do congelamento, a produção de anticorpos deve ser testada um a dois dias antes do congelamento.

2) As células podem ser congeladas por muito tempo em nitrogênio líquido sem afetar a vitalidade celular; A temperatura de -70 graus pode ser conservada por vários meses.

3) Atenção à qualidade do refrigerante. O DMSO deve ser de grau reagente, estéril e incolor (com 0. 22 micron FGLP Telflon filtrado ou comprar diretamente produtos estériles, como Sigma D-2650), em pequenos volumes de 5 a 10 ml, conservar a 4 ° C à luz e não descongelar várias vezes. O glicerol também deve ser conservado à luz após a esterilização a vapor de alta pressão. Usar no prazo de um ano após a abertura, pois pode ser tóxico para as células após armazenamento a longo prazo. Este método prepara o congelador duplo primeiro para evitar danos às células causados pelo calor liberado pela adição direta de DMSO. A lenta adição gota a gota da suspensão celular permite que as células se adaptem gradualmente à alta osmose, reduzindo o dano celular. O DMSO pode causar a diferenciação de algumas cepas de células leucemicas que podem ser substituídas por congelamento de glicerina de 10%.

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