AFDye 647 NHS éster coloração celular

AFDye 647 éster do NHS

(Equivalente de éster de Alexa Fluor 647 NHS)

Informação do produto

Descrição do produto

O Dye 647 é um corante solúvel em água e altamente fotoestável com um rendimento quântico de luz muito alto. O AFDye 647 é um corante fluorescente de infravermelho distante brilhante que pode ser excitado usando linhas espectrais de 633nm ou 647nm. É adequado para a imagem de alvos de baixa abundância, especialmente em células fixas. É muito tolerável na faixa de pH 4-10.

AFDye647 NHS ester (Equivalent toAlexa Fluor 647 NHS ester) é um corante fluorescente de infravermelho distante, geralmente marcado por betamina para proteínas ou anticorpos, polipéptidos, oligonucleótidos modificados por aminas e outras moléculas biológicas que contêm aminas. Este marcador é geralmente eficaz na faixa de pH 7-9 zui, formando ligações amida estáveis ​​e covalentes.

Características do produto

Conservação e transporte

Conservação: -20°C para conservação seca, 2 anos de validade.

Transporte: transporte de sacos de gelo.

Atenção

1) Os corantes fluorescentes têm problemas de extinção, por favor, tente evitar a luz para retardar a extinção de fluorescência.

2) AFDye NHS éster séries de corantes, embora tenha uma certa solubilidade em água, mas é altamente recomendado a solução de DMSO, DMF dissolvido para preparar a solução mãe, em seguida, o experimento de marcação. Em sistemas solúveis em água, esses grupos reativos são facilmente hidrolizados para formar formas de ácido livre não reativas.

3) Para sua segurança e saúde, por favor, use a roupa experimental e use luvas descartáveis para operação.

Etapa de coloração (por exemplo, marcação da imunoglobulina IgG)

Quase todas as proteínas ou polipéptidos podem ser marcados com reagentes de reação amina (sondas). Abaixo estão as etapas de marcação otimizadas para anticorpos IgG, onde o usuário pode ampliar ou diminuir o sistema de resposta de acordo com a quantidade de proteína, mas para obter o resultado de coloração ideal, a concentração de proteína não deve ser inferior a 2 mg / ml. Como o número de aminas contidas em diferentes proteínas (polipéptidos) e a posição da superfície das aminas variam enormemente, é recomendado que os usuários criem três grupos diferentes de reagentes aminos no experimento inicial: a proporção de molécula da proteína para selecionar a proporção de molécula que pode atingir a eficiência da marcação zuijia.

1.1 dissolve completamente ~ 10mg de proteína em 1 ml de tampão de hidrogênio sódio suan carbono 0.1M.

Nota 1: A concentração de proteína é geralmente de 5-20 mg / ml, e a taxa de sucesso do acoplamento é altamente dependente da concentração de proteína. Quando a concentração é inferior a 2 mg/ml, pode afetar gravemente a eficiência da marcação.

Nota 2: o sistema de marcação deve evitar qualquer substância amina, como Tris, glicina, sal de amônio ou outras proteínas estáveis ​​como BSA, etc. Se a solução de proteína a ser marcada contém a poluição das substâncias acima, é necessário diálise para tampão de fosfato (PBS) de 10-20 mM e adicionar 0,1 ml de tampão de hidrocarbonato 1M por ml de solução de proteína (pH 8,3-9,0) para ajustar o pH desejado.

NOTA: A presença de baixas concentrações de sódio pernitroso (<3 mM) ou mercúrio enxofreado (<1 mM) na solução de anticorpos não interfere com a resposta de marcação.

1.2 Reagir (sonda) com DMF ou DMSO de alta qualidade sem água (por exemplo, AFDye647 NHS ester) até 10 mg/ml.

Nota 1: A solução aquática do éster AFDye 488 NHS deve ser usada atualmente e não pode ser conservada, porque na solução aquática, ela será hidrolizada em ácido livre inativo. O líquido de armazenamento de DMSO do éster AFDye 488 NHS pode ser mantido a ≤ -20 ° C e é recomendado usar dentro de 2 semanas.

1.3 Adicionar lentamente 50-100 µl de reagente de reação amina (sonda) durante a agitação ou a solução de turboproteína.

Nota 1: A quantidade de reagente aminico (sonda) adicionada é de 0,5-1 mg, no geral, cerca de 1/4-1/3 do reagente aminico é acoplado à proteína. Diferentes proteínas e reagentes de marcação têm efeitos de marcação diferentes, por favor otimize a proporção de ambos de acordo com a situação específica.

1.4 Agir lentamente a temperatura ambiente para incubar com proteção de luz por 1h (ou mais).

1,5 [Opcional] Terminar a reação adicionando 0,1 ml de hidroxiamina 1,5 M (pH 8,5) recém-formulada e incubar o sistema com hidroxiamina a temperatura ambiente por 1 h.

1.6 Purificação: Escolha um método apropriado (por exemplo, diálise, coluna P-30 ou coluna PD-10) para purificar o produto marcado, removendo íons salinos ou reagentes aminados não reagidos.

1.7 Armazenamento: Proteína bem marcada é mantida à luz a 2-8 ° C. Se a concentração de acoplador de proteína purificada for inferior a 1 mg/ml, adicione BSA ou outra proteína estável de 1 a 10 mg/ml. Na presença de 2 mM de sódio nitrogenado, 2-8 ° C pode ser mantido por vários meses. Para conservar por mais tempo, deve ser mantido a -20 ° C após a partilha para evitar o congelamento repetido.

Calcular a proporção da marca (valor F/P)

Para a maioria dos anticorpos, como a imunoglobulina IgG, o coeficiente de absorção molar é de 203.000 e o valor F / P entre 4 e 9 é o mais adequado.
Calculação do valor F/P da proteína marcadora AFDye647:
1) diluir a quantidade de poucas proteínas acopladas purificadas com um múltiplo preciso de PBS para medir a absorção de luz de 280nm e 650nm em um vaso de viscosidade de 1cm;
2) Calcule a concentração de proteína na amostra: concentração molar de proteína = (A280-(A650 x 0,03)) x múltiplo de diluição / 203000
3) Cálculo da proporção do marcador: número de molar de corante ligado a proteína por molar = A650 x múltiplo de diluição / (239.000 x concentração molar de proteína)

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Escrito/editado por V. Shallan

Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. é uma empresa envolvida em pesquisa em ciências da vida e biotecnologia, reagentes, instrumentos e produtos de consumo de laboratório e serviços experimentais, principalmente em biologia celular, botânica, biologia molecular, imunologia, bioquímica e proteômica. Biofarmacêutica e produção de reagentes de diagnóstico. A empresa adere ao conceito de negócio de "pessoas centradas, honestidade como fé, contrato fiel". Atendendo ao princípio de "garantia de qualidade" para fornecer produtos de qualidade para a maioria dos clientes.