Análise de Clonagem e Expressão de Células Electrotransceptivas de Agrobacteria

Célula eletrocompetente EHA105 (pSoup)

Células eletrosensitivas agrobacterianas

Etiquetas do produto:

cepa EHA105; células agrobacterianas sensíveis; Rifampicina (Rif) rifupina; Kanamicina (kan) canameicina; EHA101； LBA4404； GV3101； AGL1； Pesquisa de plantas geneticamente modificadas;

Pedidos de produtos:maiores problemas técnicos de embalagem ou produto,

Descrição do produto:

A cepa EHA105 foi modificada a partir da cepa EHA101, com o cromossomo de fundo C58, o gene nuclear contém a etiqueta de triagem - o gene de resistência a lifu rif, para facilitar a operação de conversão, esta cepa carrega o plásmido T de base âmbar pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) sem função de transporte próprio, que contém o gene vir (o gene vir é um componente essencial para a inserção de T-DNA no genoma da planta, apesar de a função de transferência de T-DNA do próprio plásmido pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) estar comprometida, mas pode ajudar a transferência suave do T-DNA de veículo binário transferido). Transferir a cepa EHA105 para o plásmido help: pSoup, ou seja, obter: cepa EHA105 (pSoup), que ajuda os plásmidos da série pGreen, 62SK, pGs2 a se replicar em agrobacteria, ao mesmo tempo em que confere à cepa resistência à tetraciclina (tetR), adequada para a manipulação genética de plantas como arroz, tabaco e outros.

As células electrotransceptivas EHA105 (pSoup) fornecidas pela nossa empresa são fabricadas por um processo especial, especialmente adequado para a transformação de grandes plasmódios. O genótipo é C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine(pSoup-tetR), com eficiência de conversão > 105 cfu/μg de DNA por meio de testes plasmódicos pGs2.

Composição do produto:

Condições de armazenamento e transporte:

Conservação: -80 ° C, válido por 1 ano.

Transporte: Transporte de gelo seco.

Atenção

1) As células sensíveis devem ser mantidas a -80 ° C, não podem ser congeladas repetidamente e colocadas por muito tempo para não diminuir a eficiência de conversão das células sensíveis.

2) Toda a operação de conversão é estritamente realizada de acordo com a temperatura correspondente e as condições estériles.

3) O volume dos plasmídeos adicionados não deve ser maior que 1/10 do volume do estado sensível. Os plásmidos impuros ou a presença de poluição orgânica, como etanol, podem levar a uma queda dramática da eficiência da conversão. O plásmido duplica e a eficiência de conversão diminui em uma ordem de quantidade.

4) Para garantir a alta eficiência de conversão zui, todo o processo operacional deve ser tão suave quanto possível e manter a baixa temperatura.

5) A conversão de alta concentração de plásmidos pode reduzir a quantidade final de revestimento.

6) Quando a densidade de clonagem no comprimido é muito grande, o crescimento da clonagem diminui devido à deficiência nutricional e as colônias diminuem. Para obter grandes colônias, o uso de plasmídeos deve ser reduzido.

7) O objetivo da adição de rifupina ao meio de cultura é prevenir o crescimento de géreos e triagem de agrobacterias; De acordo com a resistência da cepa usada, a adição de chainmeisina ou cindameisina pode prevenir a perda de plasmídio Ti, mas a chainmeisina é desfavorável para a operação geneticamente modificada de agrobacteria, geralmente a cultura de agrobacteria não leva em consideração a chainmeisina ou cindameisina, porque a probabilidade de perda de plasmídio Ti é extremamente baixa (pode ser ignorada).

8) Para sua segurança e saúde, por favor, use a roupa experimental e use luvas descartáveis para operação.

Uso

1) Tome o copo de choque elétrico de 0,1 cm e a tampa do copo do líquido de armazenamento e coloque-o invertido no papel absorvente de água limpo por 5 minutos, mantenha a água seca, posicione-o por 5 minutos, para que o etanol seja totalmente volátil e limpo, insera-o imediatamente no gelo, compacte a superfície do gelo, o topo do copo do eletrodo fica fora do gelo por 0,5 cm para facilitar a tampa do copo, deixe-o no gelo por 5 minutos para resfriá-lo completamente.

2) Tome-80 ° C preservadas células sensíveis para inserir no gelo por 5min, até que ela derreta.

3) Adicione 0,01 ~ 1 μg (volume não superior a 6 μl) de DNA plasmídico à suspensão de células sensíveis de 50 μl, misture-o com o fundo do tubo manual bo e insera-o imediatamente no gelo. Depois de bater suavemente a célula do estado sensorial misturada com uma arma, transferir rapidamente para o copo de choque elétrico, tapar a tampa do copo e manter o tubo vazio para uso [Nota: devido à alta eficiência da conversão do estado sensorial, di usa zuihao para fazer um teste pré para determinar a quantidade de plasmórido de zuijia].

4) Iniciar o transformador, definir os parâmetros: C = 25 μF, PC = 200 ohm, V = 2400 V (este parâmetro refere-se ao Bio-rad, uso específico, consulte os passos recomendados do transformador para operar), colocar o copo de choque eletrônico rapidamente na ranhura de transformador, o choque eletrônico terminado é inserido rapidamente no gelo.

5) Adicionar 700 μl de LB sem antibióticos e transferir para um tubo de ar sensível, 2 ~ 3h de cultura oscilante a 28 ° C.

6) 6.000 rpm centrifugar 1min, retirar cerca de 100ul de limpeza superior, e depois soprar suavemente com uma pistola para bater a suspensão. Em seguida, adicione o comprimido LB ou YEB contendo os antibióticos correspondentes e aplique suavemente as células uniformemente com uma barra de vidro estéril. Posicionado em temperatura ambiente por 10 min, depois de esperar que o líquido seja absorvido, inverte o comprimido e cultive a 28 ° C por 2-3 dias. [Nota: quando o comprimido contém apenas antibióticos de veículo duplo usados ​​para a conversão, a cultura a 28 ° C é de 48 h; Quando os comprimidos adicionam antibióticos de dois veículos ao mesmo tempo, adicionando 10 μg / ml de lifupina, é necessário uma cultura de 28 ° C de 48 a 60 horas; quando os comprimidos adicionam antibióticos de dois veículos ao mesmo tempo, adicionando 20 μg / ml de lifupina, é necessário uma cultura de 28 ° C de 60 a 72 horas; não é recomendado o uso de mais de 20 μg / ml de lifupina para a cultura de comprimidos ou líquidos.

7) Cultura líquida para a finalidade da clonação:

j Pequena quantidade de bactérias agitadas: adicione 1 ml de meio líquido LB contendo antibióticos correspondentes ao tubo de respiração de fundo redondo de 15 ml, escolha 1-2 vacinações de colônia única do comprimido recém-cultivado, 30 ° C, 200rpm 24-48h.

k grande quantidade de bactérias agitadas: adicione menos de 20 ml de meio líquido LB contendo os antibióticos correspondentes na garrafa de triângulo respirado de 100 ml, tome o líquido agitado pequeno em proporção de 2% para sterilização, 30 ° C, 200rpm agitação 24-48h.

[Nota]: Para agrobacterias (aeróbicas), tanto comprimidos sólidos como agitadores líquidos precisam de grandes quantidades de oxigênio. A chave para o sucesso do agitador líquido é garantir que o meio contenha oxigênio dissolvido suficiente, que pode ser controlado através dos seguintes métodos: j com tubos respiradores ou garrafas triangulares; k garantir que o líquido nutritivo tenha uma grande seção transversal e uma pequena espessura; L Antibióticos com ou sem adição mínima, os antibióticos devem ser adicionados em baixas concentrações.

Produtos relacionados[Série de células sensuais]

Tabela 1 Fórmula de meio LB sólido e líquido

Tabela 2 Fórmula de meio YEB sólido e líquido

Tabela 3 Resumo da sensibilidade comum dos agrobacterios aos antibióticos

Escrito/editado por V. Shallan

Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. é uma empresa envolvida em pesquisa em ciências da vida e biotecnologia, reagentes, instrumentos e produtos de consumo de laboratório e serviços experimentais, principalmente em biologia celular, botânica, biologia molecular, imunologia, bioquímica e proteômica. Biofarmacêutica e produção de reagentes de diagnóstico. A empresa adere ao conceito de negócio de "pessoas centradas, honestidade como fé, contrato fiel". Atendendo ao princípio de "garantia de qualidade" para fornecer produtos de qualidade para a maioria dos clientes.