Mídio específico de células musculares lisas da artéria torácica primária em ratos

Pontos de operação:

Etapas da cultura celular:

Preparação de meios de cultivo e condições de congelamento:

1) Preparar o meio de cultura DMEM-H (adição de NaHCO3 1,5 g / L), 90%; Sério bovino, 10%. O meio de suspensão também pode ser selecionado de acordo com as necessidades experimentais para que as células 293T cresçam em suspensão.

2) Condições de cultivo: fase gás: ar, 95%; CO2, 5%. Temperatura: 37 graus Celsius, umidade da bacia de cultivo de 70% -80%.

3) Liquido congelado: 90% de meio de cultura, 10% de DMSO, atualmente disponível. Armazenamento de nitrogênio líquido.

Tratamento celular:

1) Recuperação de células: descongelar rapidamente o tubo de congelamento contendo 1mL de suspensão celular em banho de água a 37 ° C, adicionando 4mL de meio de cultura para misturar uniformemente. Centrifugar em condições de 1000RPM por 4 minutos, descartar o líquido superior e soprar bem depois de adicionar 1-2mL de meio. Em seguida, todas as suspensões celulares são adicionadas a uma garrafa para a cultura durante a noite (ou a suspensão celular é adicionada a um prato de 10 cm, adicionando cerca de 8 ml de meio para a cultura durante a noite). No dia seguinte, troce o líquido e verifique a densidade celular.

2) Transferência celular: se a densidade celular chegar a 80% -90%, a cultura de transmissão pode ser realizada.

Para as células adesivas, a transmissão pode ser feita através dos seguintes métodos:

1. Eliminar a cultura e lavar as células 1-2 vezes com PBS sem íons de cálcio e magnésio.

Adicione 2 ml de líquido digestivo (0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA) em uma garrafa de cultura, coloque-a em uma caixa de cultura de 37 ° C para digerir por 1-2 minutos, em seguida, observar a digestão celular sob o microscópio, se a maioria das células se arredondar e desmontar, rapidamente recuperar a mesa de operação, bater alguns toques na garrafa de cultura depois de adicionar uma pequena quantidade de meio para terminar a digestão.

3. Pressione 6-8ml / garrafa para adicionar o meio de cultura, suavemente batido e aspirado, centrífugo em condições de 1000RPM por 4 minutos, descarte o líquido superior, adicionando 1-2mL de líquido de cultura e soprando bem.

Divida a suspensão celular em uma proporção de 1: 2 a 1: 5 em um novo prato ou garrafa com 8 ml de meio de cultura.

3) congelamento celular: quando as células estão em bom estado de crescimento, as células podem ser congeladas. Quando as células de parede são congeladas, adicionar uma pequena quantidade depois de descartar o meio de cultura, depois que as células se arredondam, adicionar cerca de 1 ml de meio de cultura contendo soro para adicionar ao tubo de congelamento e adicionar 10% de DMSO para congelamento.

Como congelar as células?

Método de conservação congelada 1: O tubo de congelamento é colocado em 4 ° C por 30 ~ 60 minutos → vaporphase (-20 ° C por 30 minutos *) → -80 ° C por 16 ~ 18 horas (ou durante a noite) → tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

Método de conservação congelada 2: O tubo de congelamento é colocado no refrigerador programável configurado para baixar 1-3 ° C a -80 ° C por minuto, e depois colocado no tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. -20 ° C não deve exceder 1 hora para evitar que os cristais de gelo sejam grandes demais, causando a morte de células em massa, também pode pular esta etapa para colocar diretamente no frigorífico de -80 ° C, mas a taxa de sobrevivência é um pouco menor.