Kit de apoptose FITC-Annexin V/PI

Kit de apoptose FITC-Annexin V/PI

Número do produto:F6012L

Especificações do produto:100T

Condições de armazenamento:

4℃Refrigere, não congele.Expiração da embalagem。

Características espectrais:

FITC-Anexina V: Ex/Em = 494/518 nm

PI: Ex/Em = 535/617 nm (com DNA)

Introdução do produto:

FITC-Anexina V/PIKits de apoptose fornecem uma maneira rápida e fácil de marcar as células apoptoticas precoces (verde) e as células necroticas ou apoptoticas tardias(vermelho) Detecta o nível de apoptose celular. Os produtos podem ser testados usando um citométrio de fluxo ou outro dispositivo de detecção de fluorescência.

Anexo V(Proteína de membrana- Vé um peso molecular de35-36KDdoCa2+Proteína ligadora de fosfolipidos dependente, pode ser ligada ao fosfolipidilo (PScombinação seletiva.fosfolipidilo (PSDistribuído principalmente no lado interno da membrana celular, ou seja, no lado vizinho ao plasma celular. Nos primeiros estágios da apoptose celular, diferentes tipos de células liberam fosfolípidos.O acilo é virado para a superfície celular e exposto ao ambiente extracelular. Neste caso, use uma sonda de fluorescência verde.FITCMarcadoAnexo Vou seja,FITC - Anexo V，com fosfolipidilo invertido (PSEm combinação, esta apoptose celular é importante para a detecção direta da extrapolação de fosfolipidilo com citométria de fluxo ou microscópio fluorescente.Marcação. Para células necroticas ou apoptosis tardias, devido à integridade celular que foi danificada,FITC - Anexo Vpode entrar no plasma celular e no lado interno da camada de fosfolipidos.PSA ligação também faz com que as células necroticas tenham fluorescência verde.

Iodeto de Propidina (Iodeto de Propídio, PI(É umDNAEm combinação com o corante, ele pode manchar células necroticas ou células que perdem a integridade da membrana celular em apoptose tardiaNúcleo celular.PIPode ser488、532 ou546 nmA excitação do laser apresenta fluorescência vermelha.

Uso:

1. Projeto experimental:

Tubo vazio: células do grupo de controle negativo, sem adiçãoFITC-Anexina V/PI. Utilizado para ajustar a tensão.

Tubo único: células de controle positivas, apenasFITC-Anexo V/Apenas adicionarPI. Para ajustar a compensação.

Tubo de detecção: células tratadas, maisFITC-Anexina V/PI. Obtenha os dados de fluxo necessários após ajustar a compensação de tensão com tubos em branco e tubos de tintura simples.

Recolha de células:

(1) Para as células suspensas:

a.Após a estimulação da apoptose,1000 rpmCentrífuga5 minutosrecolher as células, usarPBSSuspende suavemente as células e conte. Nota:PBSA suspensão não pode ser omitida,PBSO processo de ressuspensão também desempenha o papel de lavagem das células, o que garante o seguimento.FITC-Anexo Vcombinação.

b.取5×104 -1×105uma célula suspensa,1000 rpmCentrífuga5 minutosAbandone, junte-se.100 µL 1 x Anexina VCombine o tampão para suavemente ressuspender as células.

c.Inscrever5 µL FITC-Anexina VMisture suavemente.

d.Inscrever5 µL de PILiquido de coração, misturar suavemente.

e.Temperatura ambiente( 20-25ºC )Incubação à luz10 - 15 min. Folha de alumínio pode ser usada para evitar a luz. As células podem ser resuspendidas durante a incubação.2-3para melhorar o efeito de coloração.

(2) Para as células de parede:

a.Extrair o líquido de cultura celular para um tubo centrífugo apropriado.PBSLave as células adesivas uma vez e adicione a quantidade adequada de líquido digestivo celular(Não contémEDTA)células digestivas. Incubação a temperatura ambiente para soprar suavemente pode fazer com que as células de parede pega soprar para baixo, absorvendo o líquido digestivo celular. A digestão excessiva deve ser evitada. NOTA: Para as células adesivas, as etapas digestivas são críticas. Se o tempo de digestão é curto demais, as células precisam soprar fortemente para cair, causando facilmente danos à membrana celular, resultando em falsos positivos para a necrose celular; Se o tempo de digestão for longo demais, é igualmente fácil causar danos à membrana celular e aparecer um falso positivo para a necrose celular, e pode até afetar o fosfolipidilo na membrana celular eFITC-Anexo VA combinação interfere com a detecção da apoptose celular.

b.Adicione o líquido de cultura celular coletado no passo anterior, soprar as células suavemente e transferir para dentro do tubo centrífugo,1000 rpmCentrífuga5 minutosrecolher as células, usarPBSSuspende suavemente as células e conte. NOTA: É importante adicionar a cultura celular na etapa anterior, por um lado, as células que já estão suspensas em apoptose ou necrose podem ser coletadas e, por outro lado, o soro na cultura celular pode ser eficazmente inibido ou neutralizado. Os resíduos são digeridos e degradados.FITC-Anexo VIsso resulta em falhas de coloração.

c.取5×104 -1×105uma célula suspensa,1000 rpmCentrífuga5 minutosAbandone, junte-se.100 µL 1 x Anexina VCombine o tampão para suavemente ressuspender as células.

d.Inscrever5 µL FITC-Anexina VMisture suavemente.

e.Inscrever5 µL de PILiquido de coração, misturar suavemente.

f.Temperatura ambiente(20-25ºC )Incubação à luz10 - 15 min. Folha de alumínio pode ser usada para evitar a luz. As células podem ser resuspendidas durante a incubação.2-3para melhorar o efeito de coloração.

3. Análise dos resultados:

(1) Teste de citometria de fluxo:

Após a incubação, 400 μL de 1 x tampão de ligação de Annexin V podem ser adicionados diretamente às células resuspendidas e imediatamente detectadas, FITC-Annexin V é excitada por laser de 488 nm para detectar o espectro de emissão de fluorescência a 530 nm (canal FITC) e o espectro de emissão do canal PI a cerca de 617 nm.

b. no quadrante inferior esquerdo do cronograma de dispersão do citometro de fluxo de duas variáveis, as células vivas são mostradas como (FITC-Annexin V-/PI-); Quadrante inferior direito: células apoptoticas precoces (FITCAnnexin V+/PI-); Quadrante superior direito: células necroticas e apoptoticas tardias (FITC-Annexin V+/PI+); O quadrante superior esquerdo mostra as células nucleares nuas como (FITC-Annexin V-/PI+).

(2) Detecção por microscópio fluorescente:

1.000 rpm centrífuga para 5 min, coletar as células e suavemente ressuspender as células com 400 µL 1 x tampão de ligação Annexin V. Depois de mover as células para uma placa de 96 buracos para sedimentar por um momento ou fazer uma pintura celular, coloque-as sob um microscópio fluorescente para observação.

b. FITC-Annexin V está disponível com filtros FITC e PI com filtros Cy3 ou Texas.

Atenção:

1. Antes de usar, centrifuge o produto instantaneamente para o fundo do tubo e faça experimentos posteriores.

2. Para reduzir o processo de apoptose, o processo de incubação pode ser operado no gelo, mas o tempo de incubação é prolongado pelo menos até30 minutos。

3. Como a apoptose é um processo rápido, a amostra é recomendada após a coloração1 hanálise dentro.

4. Para as células adesivas, a digestão é um passo fundamental. Se houver células flutuantes quando as células adherentes induzem a apoptose, as células flutuantes e as células adherentes devem ser coletadas após a coloração combinada. Manipule com cuidado ao lidar com células adesivas e tente evitar danos celulares artificiais. O tempo de digestão é curto demais, as células precisam soprar fortemente para cair, causando facilmente danos à membrana celular.PIingestão excessiva; O tempo de digestão é longo demais, a membrana celular é igualmente susceptível de causar danos, e pode até afetar o fosfolipidilo na membrana celular.FITC-Anexo Vcombinação. Depois que a digestão será preenchida com o fundo da placa perfurada, quando agitada, entre em contato com as células e derrame a maior parte, use a pequena quantidade restante para digerir por um tempo, até que o espaço entre as células aumente, o fundo da garrafa pode terminar. Não usar no líquido digestivoEDTA，EDTAVai afetar.Anexo VcomPScombinação.

5. Após a digestão das células adesivas, recomenda-se a restauração de cerca de30 minutosDepois da coloração, evite falsos positivos.

6. Para evitar a perda de células durante a lavagem das células, pode ser usado um grandeDicaPequeno na cabeça.DicaSucção da cabeça.

7. A concentração de uso de corantes é determinada por requisitos experimentais específicos.

8. Os corantes fluorescentes têm problemas de extinção, durante a conservação e o uso, tente evitar a luz para retardar a extinção de fluorescência.

9. Para sua segurança e saúde, por favor, use uma roupa experimental e use luvas descartáveis ​​para operar.