Microglias humanas

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separação da microglia humana do tecido cerebral; O cérebro é dividido em dois hemisférios, a córtex cerebral.(A matéria cinzenta) cobre a maior parte de cada hemisfério cerebral e é o local onde as células neurais estão concentradas. O interior é composto de fibras nervosas ou mielina. Cada hemisfério tem três faces: o lado externo (cerca de 1/3 de toda a área do córtex), o lado interno e o fundo (2/3 da área); Na superfície do hemisfério há muitas fossas ou fissuras de profundidade variada, chamadas de levantamento entre fossas ou fissuras, que aumentam significativamente a área da superfície do cérebro; As fossas importantes no lado externo do cérebro, as fissuras incluem fissuras no lado externo do cérebro, fissuras no topo da almofada e fissuras centrais. Devido à separação de três fissuras, o componente do córtex cerebral é dividido em quatro partes: frontal, superior, temporal e almofada. Os microgliais são um tipo de neuroglia, equivalente a macrofagos no cérebro e na medula espinhal, e são a principal linha de defesa imunológica no sistema nervoso central (SNC). As microglias representam cerca de 20% das células gliais no cérebro e continuam a limpar os nervos danificados, placas e substâncias infecciosas do sistema nervoso central. Numerosos estudos clínicos e neurológicos mostram que as microglias ativadas desempenham um papel importante na patologia de doenças neurodegenerativas, como Parkinson, esclerose múltipla e Alzheimer. Mas o excesso de microglias ativadas ou fora de controle pode causar neurotoxicidade. Eles são fontes importantes de fatores pró-inflamatórios e estresse oxidativo, como o fator de necrose tumoral (TNF), o óxido nítrico, a interferina e outras substâncias neurotóxicas. A principal função das células microgliais: 1 A glia aparece no processo de transformação no início do desenvolvimento do cérebro para a fase de maturidade; Quando as células programadas morrem ou, durante o desenvolvimento do cérebro, o sistema nervoso central é danificado ou sofre danos patológicos, a glia pode servir como macrofagos do cérebro; As células gliais podem expressar antígenos quando as células T CD-4 positivas são expressas em complexos de compatibilidade de tecido de classe II, podem realizar macrófagos mediados por Fc e compartilhar antígenos com células hematopoiéticas e tecidos macrófagos.
Descrição do método:

O laboratório da empresa isolou a microglia humana usando a digestão enzimática combinada com o método de adesão diferencial, após vários dias de falta de nutrientes no meio de cultura, a coleta de células descartadas foi preparada por concussão de cama agitada, o número total de células é de aproximadamente5×10? células/garrafas.
Teste de qualidade:

O laboratório da empresa separa a menstruação da microglia humanaCD11b é imunofluorescente, com pureza superior a 90%, e não contém HIV-1, HBV, HCV, brancos, bactérias, leveduras e fungos.

Meio de Cultura contémFBS、 Aditivos de crescimento, penicilina, estreptomicina, etc.

Frequência de troca de líquido cada2-3 dias de troca de líquido

Características de crescimento Colar na parede

Forma celular Barrilha, poliângulo

Características de transmissão pertencentes às células diferenciadas finais; Pertence a uma população de células não proliferadas

Liquido digestivo Lidocaína (12 milímetros)

Condições de cultivo Gas: ar,95%； CO2, 5%

Preparação

Preparação do equipamento experimental: preparação de pratos de petri estériles, garrafas de cultivo, pipetas, centrífugas, instrumentos cirúrgicos, etc., e esterilização de alta pressão ou outro tratamento de desinfecção adequado.

2. Preparação de reagentes: preparação ou compra de meios de cultura adequados, enzimas digestivas (por exemplo, colagenase, etc.), soros fetais de bovinos, reagentes duplos, etc., para garantir que sejam estériles e dentro do prazo de validade.

Preparação de fontes de tecidos ou animais experimentais: selecionar o animal adequado e realizar a anestesia ou execução correspondente, de acordo com as necessidades experimentais, para obter o tecido desejado; Ou obter a organização a partir de uma biblioteca de amostras de organização existente.

Recolha e tratamento

1. extração: em condições estériles, remover rapidamente o tecido alvo, minimizar os danos ao tecido e remover o excesso de gordura, tecido conjuntivo e outros tecidos não destinados.

Limpeza: o tecido removido será lavado várias vezes com PBS estéril pré-refrigerado para remover sangue e impurezas.

Corte: corte o tecido em pequenos pedaços de cerca de 1 - 2 mm³ para a digestão posterior.

Separação celular

1. Digestão: coloque os blocos de tecido cortados em um tubo centrífugo contendo quantidades adequadas de enzimas digestivas e digera por um tempo em um leito de agitação térmica estática de 37 ° C ou um cultivo. O tubo centrífugo pode ser agitado suavemente durante o período para tornar a digestão mais uniforme.

Terminar a digestão: quando a maioria dos blocos de tecido é digerida em suspensão de células individuais ou grupos de células pequenas, a adição de meio contendo soro termina a digestão.

Filtração e centrifugação: filtre a suspensão celular com uma seta celular para remover os fragmentos de tecido não digeridos e centrifuge o filtro à velocidade de rotação apropriada para coletar o precipitado celular.

Observação e teste celular

Observação diária: todos os dias com o microscópio invertido para observar a forma das células, o estado de crescimento, a densidade, etc., para registrar as mudanças das células, como a descoberta de poluição celular ou anormalidade, tomar as medidas adequadas em tempo útil.
Contagem celular e teste de vitalidade: quando necessário, pode ser usado para contar e testar a vitalidade das células com métodos como a coloração azul taipan para entender o crescimento das células e o estado de saúde.

I. Recolha e separação

1. Operação rápida

O tecido deve ser tratado imediatamente após a coleta para evitar a exposição prolongada a temperatura ambiente ou ambientes não nutritivos.

- Use PBS estéril ou água salina fisiológica para lavar os tecidos para remover sangue e impurezas.

2. Seleção de enzimas digestivas

- Escolha enzimas digestivas de acordo com o tipo de tecido para evitar que a digestão excessiva cause danos celulares.

O tempo de digestão é rigorosamente controlado (geralmente 10-30 minutos) e o estado de dissolução das células pode ser observado pelo microscópio.

Otimização das condições de cultivo

1. Escolha do meio

Usando meios que contêm soros ou fatores de crescimento específicos (por exemplo, DMEM, RPMI 1640, etc.), algumas células precisam adicionar insulina, EGF, etc.

- Evitar a substituição frequente de marcas ou lotes de mídia para reduzir o estresse de adaptação celular.

2. Paredes e transmissão

- A capacidade de adesão das células originais é fraca e pode exigir embalagem em pratos de petri (por exemplo, colágeno, polilisina).

A densidade é recomendada para ser controlada entre 70% e 80% durante a transmissão, e a convergência excessiva pode levar à inibição e diferenciação do contato.

III. Controle da Poluição

1. Operação estéril

- Operação em uma mesa ultra-neta durante todo o processo, usando materiais de consumo descartáveis ​​para evitar a poluição cruzada.

- Dual-anti pode ser adicionado ao meio de cultura, mas o uso a longo prazo pode afetar a atividade celular.

2. Teste de broncógenos

- Detecção regular de contaminação por brocênios (por exemplo, PCR), eliminação oportuna das células após a contaminação.

IV. Monitoramento de Estado

1. Observação diária

Verifique a morfologia celular, a densidade e a cor do meio diariamente para substituir o meio em tempo útil (geralmente a cada 2-3 dias).

Morfologia anormal (por exemplo, redondecimento celular, aumento de fragmentos) pode indicar poluição ou deficiência nutricional.

2. Transmissão e congelamento

O número limitado de divisões das células progenitoras (geralmente 5-10 gerações) requer o congelamento oportuno das células progenitoras.

- O líquido congelado é recomendado para o uso de soro DMSO + (ou meio de congelação dedicado), conservação de nitrogênio líquido após o resfriamento gradiente.