Células endoteliais microvasculares pulmonares humanas

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O endotelio microvascular pulmonar humano é separado do tecido pulmonar; Os pulmões são os órgãos respiratórios do corpo, localizados no peito, cada um à esquerda e à direita, cobertos acima do coração. O pulmão tem folhas, duas à esquerda e três à direita, totalizando cinco folhas. O sistema pulmonar-transpulmonar (refere-se aos tubos respiratórios, brônicos, etc.) está ligado à garganta e ao nariz, portanto, a garganta é chamada de porta do pulmão e o nariz é o caminho externo do pulmão. As células endoteliais microvasculares estão intimamente envolvidas em uma série de respostas fisiológicas e inflamatórias, incluindo regeneração, desenvolvimento e cicatrização de feridas. As células são em forma de nave ou poliangular, e formam uma única camada em forma de pedra ou pavimento. As células endoteliais microvasculares pulmonares formam uma barreira semiseletiva que é importante para a troca de gases pulmonares, regulando o fluxo de líquidos e solúveis entre o sangue e o intermédio pulmonar.

Descrição do método:

O endotelio microvascular pulmonar humano isolado em laboratório foi preparado por meio do método de placagem de tecido e combinado com a triagem de cultura de meios específicos de células endoteliais, com um volume total de células de aproximadamente 5 x 105 células / garrafa.

Teste de qualidade:

O endotélio microvascular pulmonar humano isolado em laboratório foi identificado por imunofluorescência CD31, com pureza superior a 90%, e não contém HIV-1, HBV, HCV, brancos, bactérias, leveduras e fungos.

Condições do pacotePLL (0,1 mg/ml) ou gelatina (0,1%)

Meio de CulturaFBS, aditivos de crescimento, penicilina, estreptomicina, etc.

Frequência de troca de líquidoTroque o líquido a cada 2-3 dias.

Características de crescimentoColar na parede

Forma celularTipo de células endoteliais

Características de transmissãoTransmissão de 2-3 gerações

Liquido digestivo0.25%

Preparação

Preparação do equipamento experimental: preparação de pratos de petri estériles, garrafas de cultivo, pipetas, centrífugas, instrumentos cirúrgicos, etc., e esterilização de alta pressão ou outro tratamento de desinfecção adequado.

2. Preparação de reagentes: preparação ou compra de meios de cultura adequados, enzimas digestivas (por exemplo, colagenase, etc.), soros fetais de bovinos, reagentes duplos, etc., para garantir que sejam estériles e dentro do prazo de validade.

Preparação de fontes de tecidos ou animais experimentais: selecionar o animal adequado e realizar a anestesia ou execução correspondente, de acordo com as necessidades experimentais, para obter o tecido desejado; Ou obter a organização a partir de uma biblioteca de amostras de organização existente.

Recolha e tratamento

1. extração: em condições estériles, remover rapidamente o tecido alvo, minimizar os danos ao tecido e remover o excesso de gordura, tecido conjuntivo e outros tecidos não destinados.

Limpeza: o tecido removido será lavado várias vezes com PBS estéril pré-refrigerado para remover sangue e impurezas.

Corte: corte o tecido em pequenos pedaços de cerca de 1 - 2 mm³ para a digestão posterior.

Separação celular

1. Digestão: coloque os blocos de tecido cortados em um tubo centrífugo contendo quantidades adequadas de enzimas digestivas e digera por um tempo em um leito de agitação térmica estática de 37 ° C ou um cultivo. O tubo centrífugo pode ser agitado suavemente durante o período para tornar a digestão mais uniforme.

Terminar a digestão: quando a maioria dos blocos de tecido é digerida em suspensão de células individuais ou grupos de células pequenas, a adição de meio contendo soro termina a digestão.

Filtração e centrifugação: filtre a suspensão celular com uma seta celular para remover os fragmentos de tecido não digeridos e centrifuge o filtro à velocidade de rotação apropriada para coletar o precipitado celular.

Observação e teste celular

Observação diária: todos os dias com o microscópio invertido para observar a forma das células, o estado de crescimento, a densidade, etc., para registrar as mudanças das células, como a descoberta de poluição celular ou anormalidade, tomar as medidas adequadas em tempo útil.
Contagem celular e teste de vitalidade: quando necessário, pode ser usado para contar e testar a vitalidade das células com métodos como a coloração azul taipan para entender o crescimento das células e o estado de saúde.

I. Recolha e separação

1. Operação rápida

O tecido deve ser tratado imediatamente após a coleta para evitar a exposição prolongada a temperatura ambiente ou ambientes não nutritivos.

- Use PBS estéril ou água salina fisiológica para lavar os tecidos para remover sangue e impurezas.

2. Seleção de enzimas digestivas

- Escolha enzimas digestivas de acordo com o tipo de tecido para evitar que a digestão excessiva cause danos celulares.

O tempo de digestão é rigorosamente controlado (geralmente 10-30 minutos) e o estado de dissolução das células pode ser observado pelo microscópio.

Otimização das condições de cultivo

1. Escolha do meio

Usando meios que contêm soros ou fatores de crescimento específicos (por exemplo, DMEM, RPMI 1640, etc.), algumas células precisam adicionar insulina, EGF, etc.

- Evitar a substituição frequente de marcas ou lotes de mídia para reduzir o estresse de adaptação celular.

2. Paredes e transmissão

- A capacidade de adesão das células primitivas é fraca e pode exigir embalagem em pratos de petri (por exemplo, colágeno, polilisina).

A densidade é recomendada para ser controlada entre 70% e 80% durante a transmissão, e a convergência excessiva pode levar à inibição e diferenciação do contato.

III. Controle da Poluição

1. Operação estéril

- Operação em uma mesa ultra-neta durante todo o processo, usando materiais de consumo descartáveis ​​para evitar a poluição cruzada.

- Dual-anti pode ser adicionado ao meio de cultura, mas o uso a longo prazo pode afetar a atividade celular.

2. Teste de broncógenos

- Detecção regular de contaminação por brocênios (por exemplo, PCR), eliminação oportuna das células após a contaminação.

IV. Monitoramento de Estado

1. Observação diária

Verifique a morfologia celular, a densidade e a cor do meio diariamente para substituir o meio em tempo útil (geralmente a cada 2-3 dias).

Morfologia anormal (por exemplo, redondecimento celular, aumento de fragmentos) pode indicar poluição ou deficiência nutricional.

2. Transmissão e congelamento

O número limitado de divisões das células progenitoras (geralmente 5-10 gerações) requer o congelamento oportuno das células progenitoras.

- O líquido congelado é recomendado para o uso de soro DMSO + (ou meio de congelação dedicado), conservação de nitrogênio líquido após o resfriamento gradiente.