Fibrocitos ovarianos humanos

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separação das fibras ovarianas humanas do tecido ovariano; Os ovários são os órgãos reprodutivos das fêmeas e a função dos ovários é produzir ovos e hormônios esteroides. Os ovários estão localizados na mesma posição que os testículos, apenas no lado esquerdo (o lado direito está degradado), em forma de uva, todos são folículos em diferentes períodos de desenvolvimento, folículos amarelos e vasos sanguíneos densos na superfície dos ovários. O tamanho dos ovários está relacionado com a idade e a ovulação. A maioria dos vertebrados tem dois ovários, mas alguns peixes têm dois ovários fundidos em uma única estrutura, enquanto todas as aves têm apenas o ovário esquerdo funcionando. Os ovários são órgãos genitais redondos com um par de ovos localizados em ambos os lados do útero, com uma camada externa de tecido epitelial e uma camada fina de tecido conjuntivo abaixo dele. A estrutura interna dos ovários pode ser dividida em córtex e medula. A córtex está localizada na parte circundante do ovário, composta principalmente de folículos e tecido conjuntivo; A medula está localizada no centro e é formada por tecido conjuntivo poroso, que contém muitos vasos sanguíneos, linfáticos e nervos. Fibrocitos (O fibroblasto é o principal componente celular do tecido ligativo poroso, derivado da diferenciação das células mesoclámicas durante o período embrionário; Fibrocitos são maiores, contorno claro, principalmente uma estrutura plana em forma de martelo ou estrela saliente, seu núcleo celular é regularmente redondo, o núcleo é grande e evidente. A atividade funcional da fibroblaste é intensa, a citoplasma é débil e alcalina, com atividade de síntese e secreção de proteínas evidentes, sob certas condições, pode alcançar a transformação mútua com as fibroblastes; Os fibroblastos desempenham um papel importante na reparação de diferentes graus de degeneração celular, necrosis e defeitos de tecidos. Os fibrócitos ovarianos recém-isolados são redondos, bem refractórios e suspensos no meio de cultura. 30min de adesão celular à parede, em que parte começa a estender os pés falsos, manifestando-se como um pequeno protuberância; Após 6h, a parede celular básica é completa, estendida em uma nave, o núcleo celular é claro, distribuído mais uniformemente, espalhado no crescimento, não agrupado; As células crescem rapidamente, em 5-7 dias, em estado de fusão, as células estão bem alinhadas, algumas se sobrepõem, são planas, o corpo celular é maior, o citoplasma é transparente, o núcleo celular é maior, é oval e de cor clara. as células se fundem e se ligam umas às outras em uma rede; As células apresentam uma distribuição plana em forma de martel ou estrela saliente. Os fibroblastos ovarianos são principalmente distribuídos na superfície dos ovários, suas principais características e funções: 1 fibroblastos são fáceis de cultivar in vitro; Após a lesão dos ovários, os fibroblastos podem reparar e remodelar os ovários; É possível controlar eficazmente a propagação da inflamação durante a inflamação dos ovários.
Descrição do método:

A adoção de fibras de ovário humano separado em laboratório da empresaYi protease-colagenase mistura digestiva combinada com o método de adesão diferencial preparado, o número total de células é de cerca de 5 x 10. células/garrafas.
Teste de qualidade:

Laboratório da empresa separa ovario humano fibrogenesisA Vimentin é imunofluorescente, com pureza superior a 90%, e não contém HIV-1, HBV, HCV, biógenos, bactérias, leveduras e fungos.

Meio de Cultura contémFBS、 Aditivos de crescimento, penicilina, estreptomicina, etc.

Frequência de troca de líquido cada2-3 dias de troca de líquido

Características de crescimento Colar na parede

Forma celular Fibrocitos

Características de transmissão TransmissívelCerca de 5 gerações; Estado dentro de 3 gerações

Liquido digestivo 0,25% Yi Protease

Condições de cultivo Gas: ar,95%； CO2, 5%

Preparação

Preparação do equipamento experimental: preparação de pratos de petri estériles, garrafas de cultivo, pipetas, centrífugas, instrumentos cirúrgicos, etc., e esterilização de alta pressão ou outro tratamento de desinfecção adequado.

2. Preparação de reagentes: preparação ou compra de meios de cultura adequados, enzimas digestivas (por exemplo, colagenase, etc.), soros fetais de bovinos, reagentes duplos, etc., para garantir que sejam estériles e dentro do prazo de validade.

Preparação de fontes de tecidos ou animais experimentais: selecionar o animal adequado e realizar a anestesia ou execução correspondente, de acordo com as necessidades experimentais, para obter o tecido desejado; Ou obter a organização a partir de uma biblioteca de amostras de organização existente.

Recolha e tratamento

1. extração: em condições estériles, remover rapidamente o tecido alvo, minimizar os danos ao tecido e remover o excesso de gordura, tecido conjuntivo e outros tecidos não destinados.

Limpeza: o tecido removido será lavado várias vezes com PBS estéril pré-refrigerado para remover sangue e impurezas.

Corte: corte o tecido em pequenos pedaços de cerca de 1 - 2 mm³ para a digestão posterior.

Separação celular

1. Digestão: coloque os blocos de tecido cortados em um tubo centrífugo contendo quantidades adequadas de enzimas digestivas e digera por um tempo em um leito de agitação térmica estática de 37 ° C ou um cultivo. O tubo centrífugo pode ser agitado suavemente durante o período para tornar a digestão mais uniforme.

Terminar a digestão: quando a maioria dos blocos de tecido é digerida em suspensão de células individuais ou grupos de células pequenas, a adição de meio contendo soro termina a digestão.

Filtração e centrifugação: filtre a suspensão celular com uma seta celular para remover os fragmentos de tecido não digeridos e centrifuge o filtro à velocidade de rotação apropriada para coletar o precipitado celular.

Observação e teste celular

Observação diária: todos os dias com o microscópio invertido para observar a forma das células, o estado de crescimento, a densidade, etc., para registrar as mudanças das células, como a descoberta de poluição celular ou anormalidade, tomar as medidas adequadas em tempo útil.
Contagem celular e teste de vitalidade: quando necessário, pode ser usado para contar e testar a vitalidade das células com métodos como a coloração azul taipan para entender o crescimento das células e o estado de saúde.

I. Recolha e separação

1. Operação rápida

O tecido deve ser tratado imediatamente após a coleta para evitar a exposição prolongada a temperatura ambiente ou ambientes não nutritivos.

- Use PBS estéril ou água salina fisiológica para lavar os tecidos para remover sangue e impurezas.

2. Seleção de enzimas digestivas

- Escolha enzimas digestivas de acordo com o tipo de tecido para evitar que a digestão excessiva cause danos celulares.

O tempo de digestão é rigorosamente controlado (geralmente 10-30 minutos) e o estado de dissolução das células pode ser observado pelo microscópio.

Otimização das condições de cultivo

1. Escolha do meio

Usando meios que contêm soros ou fatores de crescimento específicos (por exemplo, DMEM, RPMI 1640, etc.), algumas células precisam adicionar insulina, EGF, etc.

- Evitar a substituição frequente de marcas ou lotes de mídia para reduzir o estresse de adaptação celular.

2. Paredes e transmissão

- A capacidade de adesão das células primitivas é fraca e pode exigir embalagem em pratos de petri (por exemplo, colágeno, polilisina).

A densidade é recomendada para ser controlada entre 70% e 80% durante a transmissão, e a convergência excessiva pode levar à inibição e diferenciação do contato.

III. Controle da Poluição

1. Operação estéril

- Operação em uma mesa ultra-neta durante todo o processo, usando materiais de consumo descartáveis ​​para evitar a poluição cruzada.

- Dual-anti pode ser adicionado ao meio de cultura, mas o uso a longo prazo pode afetar a atividade celular.

2. Teste de broncógenos

- Detecção regular de contaminação por brocênios (por exemplo, PCR), eliminação oportuna das células após a contaminação.

IV. Monitoramento de Estado

1. Observação diária

Verifique a morfologia celular, a densidade e a cor do meio diariamente para substituir o meio em tempo útil (geralmente a cada 2-3 dias).

Morfologia anormal (por exemplo, redondecimento celular, aumento de fragmentos) pode indicar poluição ou deficiência nutricional.

2. Transmissão e congelamento

O número limitado de divisões das células progenitoras (geralmente 5-10 gerações) requer o congelamento oportuno das células progenitoras.

- O líquido congelado é recomendado para o uso de soro DMSO + (ou meio de congelação dedicado), conservação de nitrogênio líquido após o resfriamento gradiente.