Células endoteliais microvasculares da retina humana

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separação do tecido auto-retinal endotelial microvascular da retina humana; A retina está localizada na camada interna da parede do olho e é uma camada fina transparente. A retina é composta por uma camada epicórtica pigmentada e uma camada sensorial da retina, que podem ser separadas em casos patológicos, chamado de separação da retina. A epicórtes pigmentada está intimamente ligada à retina e é composta por células epiteliais pigmentadas que desempenham funções como apoio e nutrição das células fotorreceptoras, escuridão, dissipação de calor e regeneração e reparação. Histologicamente a retina superior é dividida em10 camadas, de fora para dentro são: epicórtes pigmentados, conos, camadas de células da barra visual, membrana externa, camadas de partículas externas, camadas de partículas externas, camadas de partículas internas, camadas de partículas internas, camadas de células ganglionais, camadas de fibras nervosas e membranas internas. A camada interna da retina é uma camada fina revestida dentro da membrana vascular, com efeito fotosensível; Na parte traseira do nariz há um mamilo do nervo visual. A camada sensorial da retina é composta por três neurônios. Os neurônios são uma camada de células ópticas, especializadas em sensores de luz, que incluem células cones e células rod. As células da barra de visão estão principalmente na retina mais distante da concave central, enquanto as células conicas estão mais presentes na concave central. A segunda camada é chamada de ganglios, onde cerca de 10 a centenas de células ópticas estão ligadas a um ganglio através de ganglios e são responsáveis ​​pela função de ligação. A terceira camada é chamada camada de células ganglionárias, condução exclusiva. A retina é uma estrutura fina, mas muito complexa, que é pega na parede traseira do globo ocular, transmitindo fibras nervosas de impulsos dos receptores retinais através da superfície da retina para chegar à saída através do nervo óptico. A resolução da retina é desigual e, na área macular, sua capacidade de resolução é forte. É uma célula epitelial plana de camada única que compõe a superfície da cavidade vascular, a substância bioativa produzida e secreta tem um papel importante na manutenção da tensão vascular, na regulação da pressão arterial, na formação antitrombólica, etc., no mecanismo patológico da doença vascular da retina. Como as células endoteliais obtidas de diferentes tecidos e órgãos têm propriedades diferentes, no cérebro e na retina, essas células endoteliais desempenham a função de barreira interna e desempenham um papel importante na regulação do estado fisiológico vascular, na liberação de substâncias ativas vasculares e na formação de vasos sanguíneos neogêneos, a cultura de isolação in vitro RCEC tem importância clínica importante para o estudo dos mecanismos patofisiológicos do desenvolvimento da doença vascular da retina e para a prevenção precoce da doença.
Descrição do método:

Endotel microvascular retinal humano isolado em laboratório da empresa usando colagenaseO método de digestão mixta neutra da albinase combinado com o método de centrifugação de gradiente de densidade, e finalmente preparado através da triagem de cultura de meio específico de células endoteliais, o volume total de células é de aproximadamente 5 x 10. células/garrafas.
Teste de qualidade:

Microvascular endotelial retinal humana isolada em laboratório da empresaCD31 é imunofluorescente, com pureza superior a 90%, e não contém HIV-1, HBV, HCV, brancos, bactérias, leveduras e fungos.

Condições do pacote PLL（0.1mg/ml）， Gelatina (0,1%)

Meio de Cultura contémFBS、 Aditivos de crescimento, penicilina, estreptomicina, etc.

Frequência de troca de líquido cada2-3 dias de troca de líquido

Características de crescimento Colar na parede

Forma celular Tipo de células endoteliais

Características de transmissão Transmissível2-3 gerações

Liquido digestivo 0,25% Yi Protease

Condições de cultivo Gas: ar,95%； CO2, 5%

Preparação

Preparação do equipamento experimental: preparação de pratos de petri estériles, garrafas de cultivo, pipetas, centrífugas, instrumentos cirúrgicos, etc., e esterilização de alta pressão ou outro tratamento de desinfecção adequado.

2. Preparação de reagentes: preparação ou compra de meios de cultura adequados, enzimas digestivas (por exemplo, colagenase, etc.), soros fetais de bovinos, reagentes duplos, etc., para garantir que sejam estériles e dentro do prazo de validade.

Preparação de fontes de tecidos ou animais experimentais: selecionar o animal adequado e realizar a anestesia ou execução correspondente, de acordo com as necessidades experimentais, para obter o tecido desejado; Ou obter a organização a partir de uma biblioteca de amostras de organização existente.

Recolha e tratamento

1. extração: em condições estériles, remover rapidamente o tecido alvo, minimizar os danos ao tecido e remover o excesso de gordura, tecido conjuntivo e outros tecidos não destinados.

Limpeza: o tecido removido será lavado várias vezes com PBS estéril pré-refrigerado para remover sangue e impurezas.

Corte: corte o tecido em pequenos pedaços de cerca de 1 - 2 mm³ para a digestão posterior.

Separação celular

1. Digestão: coloque os blocos de tecido cortados em um tubo centrífugo contendo quantidades adequadas de enzimas digestivas e digera por um tempo em um leito de agitação térmica estática de 37 ° C ou um cultivo. O tubo centrífugo pode ser agitado suavemente durante o período para tornar a digestão mais uniforme.

Terminar a digestão: quando a maioria dos blocos de tecido é digerida em suspensão de células individuais ou grupos de células pequenas, a adição de meio contendo soro termina a digestão.

Filtração e centrifugação: filtre a suspensão celular com uma seta celular para remover os fragmentos de tecido não digeridos e centrifuge o filtro à velocidade de rotação apropriada para coletar o precipitado celular.

Observação e teste celular

Observação diária: todos os dias com o microscópio invertido para observar a forma das células, o estado de crescimento, a densidade, etc., para registrar as mudanças das células, como a descoberta de poluição celular ou anormalidade, tomar as medidas adequadas em tempo útil.
Contagem celular e teste de vitalidade: quando necessário, pode ser usado para contar e testar a vitalidade das células com métodos como a coloração azul taipan para entender o crescimento das células e o estado de saúde.

I. Recolha e separação

1. Operação rápida

O tecido deve ser tratado imediatamente após a coleta para evitar a exposição prolongada a temperatura ambiente ou ambientes não nutritivos.

- Use PBS estéril ou água salina fisiológica para lavar os tecidos para remover sangue e impurezas.

2. Seleção de enzimas digestivas

- Escolha enzimas digestivas de acordo com o tipo de tecido para evitar que a digestão excessiva cause danos celulares.

O tempo de digestão é rigorosamente controlado (geralmente 10-30 minutos) e o estado de dissolução das células pode ser observado pelo microscópio.

Otimização das condições de cultivo

1. Escolha do meio

Usando meios que contêm soros ou fatores de crescimento específicos (por exemplo, DMEM, RPMI 1640, etc.), algumas células precisam adicionar insulina, EGF, etc.

- Evitar a substituição frequente de marcas ou lotes de mídia para reduzir o estresse de adaptação celular.

2. Paredes e transmissão

- A capacidade de adesão das células primitivas é fraca e pode exigir embalagem em pratos de petri (por exemplo, colágeno, polilisina).

A densidade é recomendada para ser controlada entre 70% e 80% durante a transmissão, e a convergência excessiva pode levar à inibição e diferenciação do contato.

III. Controle da Poluição

1. Operação estéril

- Operação em uma mesa ultra-neta durante todo o processo, usando materiais de consumo descartáveis ​​para evitar a poluição cruzada.

- Dual-anti pode ser adicionado ao meio de cultura, mas o uso a longo prazo pode afetar a atividade celular.

2. Teste de broncógenos

- Detecção regular de contaminação por brocênios (por exemplo, PCR), eliminação oportuna das células após a contaminação.

IV. Monitoramento de Estado

1. Observação diária

Verifique a morfologia celular, a densidade e a cor do meio diariamente para substituir o meio em tempo útil (geralmente a cada 2-3 dias).

Morfologia anormal (por exemplo, redondecimento celular, aumento de fragmentos) pode indicar poluição ou deficiência nutricional.

2. Transmissão e congelamento

O número limitado de divisões das células progenitoras (geralmente 5-10 gerações) requer o congelamento oportuno das células progenitoras.

- O líquido congelado é recomendado para o uso de soro DMSO + (ou meio de congelação dedicado), conservação de nitrogênio líquido após o resfriamento gradiente.