Modelo Animal ZFN

NegociávelAtualização em03/04

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Modelos animais de ZFNs: Os modelos animais de zinc finger nuclease (ZFNs) são modelos animais experimentais construídos usando técnicas de edição de genes de zinc finger nuclease. A nuclease do dedo de zinco é formada pela fusão da proteína do dedo de zinco (ZFP) e da nuclease (FokI), que é capaz de se ligar especificamente à sequência do DNA alvo, enquanto a nuclease é responsável por cortar o DNA, introduzindo a ruptura da dupla cadeia em locais específicos do gene, induzindo mecanismos de reparação da célula que permitem knock-out, knock-in ou mutação do gene.

Detalhes do produto

Um,Modelo Animal ZFNPrincípios técnicos e mecanismos básicos

ZFNs sãoPrimeira geração de ferramentas de edição de genes programáveisatravés da integraçãoDomínio de ligação de DNA(Proteína do dedo de zinco) eDomínio de corte de DNA(FokI Nucleatase) Realizar a edição direcionada:

Domínio da proteína do dedo de zinco：

por30-34 unidades de repetição de aminoácidosComposição, cada unidade passaResiduos variáveis de 12 e 13 bits (RVDs)Identificação de bases específicas:

Tipo RVD	Identificação da base	Especificação
NI	Um	alto
NG	O T	alto
HD	O C	alto
NN	G / A	Médio

Identificação de dedo de zinco único3 bpConjunto de 3 a 6 alvos9-18 bpSequência.

Domínio de corte FokI：

NecessidadePolimerizaçãoPara ativar a função de corte → Os ZFNs precisam ser projetados em pares (braço esquerdo/braço direito) e o local de corte está localizado entre os locais de ligação dos braços (intervalo de 5-7 bp).

Mecanismo de edição：

Fratura de cadeia dupla (DSB) → via de reparação iniciada pela célula:

Conexão terminal não homogênica (NHEJ)Inserção aleatória / ausência (Indels), que resulta em knockout genético.
Reparação direcionada homogênica (HDR)Requer um modelo de reparação exótica (como ssODN) para mutações pontuais ou inserções de genes.

avanço tecnológicoshou realizaçãoDirecionamento ao genoma de mamíferos(2005), iniciando a era da edição genética precisa.

Dois.Modelo Animal ZFNOtimização de processos e tecnologia

a) Etapas operacionais padronizadas

Otimização de parâmetros técnicos chave

Passos	Operações principais	Otimização inovadora
Projeto de alvo	Evite áreas de alta repetição / metilação, com intervalos de 5-7 bp	Previsão de software (ZiFiT) melhora a eficiência da combinação
Montagem dedo de zinco	Conexão modular：

3-6 unidades de dedo de zinco em série
Clone do Golden Gate (BsaI/BsmBI) | Construção concluída em 6 dias, taxa de sucesso >80% |
|Carreira de expressãoSubveículos iniciadores duplos (CMV/T7) para suportar a síntese de mRNA e a expressão de proteínas.
|Modo de entregaMicroinjeção de ZFNs mRNA
Transfeção somática + transplante nuclear (animais grandes) | Redução da entrega de mRNA fora do alvo |
|Melhorias de reparação| Modelo ssODN combinado + inibidor NHEJ (SCR7) | Eficiência HDR 3 vezes maior |

Casos de aplicação de várias espécies e vantagens do modelo

Espécies típicas e modelos de doenças

Espécies	Genas alvo	Modelo da doença	Eficiência / Fenotipo	Valor da pesquisa
Peixe Zebra	dourado	Albinismo	95% Falta de procromo F0	Triagem da Função Genética de Desenvolvimento
Rato	Rag2/IL2rg (em inglês)	Modelo de imunodeficiencia	Knockout genético duplo, plataforma de transplante humana	Estudo de imunoterapia tumoral
Porcos	GGTA1	Modelo de transplante de guan	Elimina o antígeno α-Gal para reduzir a rejeição ultraaguda	Desenvolvimento de órgãos humanos
Moscas da fruta	amarelo	Mutações de cor corporal	Taxa de mutação da linhagem reprodutiva 5,7% (modelo animal)	Validação conservadora da função genética

b) Aplicações insubstituíveis

Editor de regiões de alto GC：

Sem restrições de sequência PAM, direciona-se a áreas que não podem ser editadas pelo CRISPR/Cas9.

Necessidade de baixa taxa de desdirecionamento：

Taxa de desvio na edição terapêutica < 0,1% (CRISPR 1-10%).

Modelo animal grande：

Espécies como suínos e vacas são menos imunogênicas do que o CRISPR.

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